MOVILIDAD DE Bradyrhizobium spp. EN EL SUELO.
Adriana Gabriela López Guerra, Carolina Cogo, Ma. Julia Althabegoiti, Aníbal R. Lodeiro
El desafío de esta línea consiste en desarrollar métodos y enfoques que nos permitan entender la movilidad de Bradyrhizobium spp. en su ambiente natural, que por su naturaleza, es un material oscuro, tortuoso e irregular donde el movimiento bacteriano no puede ser observado en forma directa con alta resolución microscópica. Las características antes mencionadas condicionan el movimiento bacteriano dentro de los canalículos de agua a punto tal que gran parte del conocimiento existente sobre la movilidad bacteriana en medios acuosos homogéneos no puede ser extrapolado directamente al movimiento bacteriano en el suelo.
Por otra parte, el contenido de agua del suelo es variable tanto en el tiempo como en el espacio, dependiendo del momento en que se producen aportes de agua ¾p.ej. lluvias¾ como de la textura y estructura local, que condiciona el tamaño de los poros y la capacidad de retención hídrica. Los rizobios son capaces de nadar usando sus flagelos cuando hay agua disponible, y al parecer, lo hacen cerca de las superficies interiores de los poros del suelo, explorando y dispersándose en el ambiente mientras el contenido hídrico lo permite. Esto requiere de un gran control tanto de la expresión de los flagelos como de la producción de energía necesaria para moverlos, y asimismo una sensibilidad a los quimiotrayentes para orientar el movimiento en ese ambiente irregular.
Así, nuestros trabajos parten del uso de mutantes específicos obtenidos en otras líneas del LIRyS para estudiarlos en diseños experimentales que simulan el suelo y obtener información acerca de las velocidades de dispersión, las características del movimiento y la energía utilizada. Con la información obtenida, intentamos desarrollar modelos matemáticos que puedan simular la dispersión de un inoculante en el suelo, y con ello contribuir a mejorar las formulaciones y tecnologías de aplicación de los inoculantes para favorecer una óptima distribución de los rizobios inoculados en la zona del suelo explorada por las raíces del cultivo.

DETERMINANTES GENÉTICOS DE LA MOVILIDAD Y ESTUDIOS EVOLUTIVOS DE LOS SISTEMAS DE FLAGELOS EN EL GÉNERO Bradyrhizobium spp.
María Julia Althabegoiti, Aníbal Lodeiro
Los biofertilizantes formulados con rizobios permiten, por medio del establecimiento de la simbiosis, que las plantas empleen el N₂ cuando los suelos están desprovistos de formas de N asimilables como NH₄. Se ha propusto que la movilidad de estos rizobios juega un rol fundamental al momento de la colonización y competición para la nodulación. Para la biofertilizacion del cultivo de soja se emplean las especies de B. japonicum, B. diazoefficiens y B. elkanii. En el caso de B. diazoefficiens un mutantes más móvil obtenido en nuestro laboratorio por selección artificial ha resultado más competitivo a campo y consecuentemente ha aumentado el rendimiento del cultivo de soja. Actualmente estamos analizando los cambios genéticos que condujeron a dicho fenotipo que, curiosamente, no se produjeron en genes relacionados al flagelo o la quimiotaxis.
También en relación con la movilidad del género Bradyrhizobium, hemos observado que hay especies que tienen dos sistemas flagelares y otras que presentan un único sistema. El flagelo subpolar parecería ser el ancestral mientras que el lateral parece haberse adquirido por transferencia horizontal. Actualmente estamos analizando el patrón de distribución del flagelo lateral (adquirido). Siendo el flagelo una estructura que otorga ventajas adaptativas pero a la vez es energéticamente muy costosa, resulta interesante estudiar la funcionalidad de ambos sistemas y qué sucede en aquellas especies donde existe un único flagelo. Para tal fin, en el laboratorio disponemos de mutantes que tienen únicamente el flagelo subpolar o el lateral, así como una colección de bradyrizobios que incluye diferentes especies y cepas tipo, así como aislamientos con diferentes orígenes geográficos.

ESTUDIO GENÓMICO-FUNCIONAL DE LOS SISTEMAS DE FLAGELOS DE Bradyrhizobium diazoefficiens.
Elías Mongiardini, Ignacio Quelas, Carolina Dardis y Florencia Mengucci
El proyecto involucra la caracterización genómica de los genes que codifican los dos sistemas de flagelos que expresa B. diazoefficiens. Estamos caracterizando la regulación de la síntesis de estos dos flagelos y las señales involucradas. En el caso del flagelo lateral que se expresa de manera inducible, estamos caracterizando el rol de las señales que inducen su expresión, como la fuente de carbono presente en el medio de cultivo o la viscocidad del medio. En el caso del flagelo subpolar que se expresa de manera constitutiva y podría estar relacionado al ciclo celular de la bacteria, estamos caracterizando el sistema que controla su síntesis utilizando Caulobacter como modelo. Además, para este flagelo, estamos estudiando varias histidina kinasas que también podrían estar involucradas en la señalización de la regulación, así como el rol del segundo mensajero, c-di-GMP, y las enzimas encargadas de su síntesis y degradación.

BIOFERTILIZANTES GRANULADOS DE ALTA EFICIENCIA PARA LA INOCULACIÓN DE SOJA EN EL SURCO DE SIEMBRA
Esteban Tomás Iturralde, Julieta Pérez Giménez, Aníbal Lodeiro
Dentro del grupo de trabajo esta línea tendría una directa aplicabilidad biotecnológica ya que tiene como objetivo general aumentar la productividad por hectárea de los cultivos de soja a través del empleo de biofertilizantes mejorados, aptos para ser inoculados en el surco de siembra, minimizando su costo y las complicaciones logísticas inherentes a su aplicación.
El 94% de los productores de soja emplea regularmente inoculantes conteniendo Bradyrhizobium spp. (B. japonicum o B. diazoefficiens) pese a que en los suelos normalmente habitan poblaciones de rizobios noduladores de soja derivados de antiguos inoculantes que sobrevivieron en el ambiente. Esta práctica se basa en la idea de que los rizobios de la población del suelo son menos eficientes para la fijación de N₂ que los inoculados, ya que estos últimos siempre son cepas seleccionadas de alta calidad. Los inoculantes son aplicados usualmente a las semillas previo a la siembra e incluso se comercializan actualmente semillas preinoculadas. Sin embargo, diversas investigaciones indican que esta forma de inocular es ineficiente para promover una buena ocupación de los nódulos por parte de las bacterias inoculadas en competición con las de la población del suelo. Esto se debe a que las bacterias inoculadas se adhieren fuertemente a las superficies seminales y luego no se dispersan en el suelo, con lo cual no hay una buena distribución de los rizobios inoculados en la región de suelo que rodea las raíces en crecimiento. En cambio, parece preferible la inoculación directa del suelo, practicada en el surco de siembra, la cual mejora la distribución de los rizobios y con ello, la competitividad del inoculante para la ocupación de los nódulos. Pese a los mejores resultados obtenidos con esta técnica tanto en porcentajes de ocupación de nódulos como en aumento de rendimiento en grano, los productores se muestran reticentes a su empleo. Ello es debido a que los inoculantes para surco de siembra existentes en el mercado son de formulación líquida, y su aplicación requiere el transporte de grandes volúmenes de agua, con la consecuente complicación logística. Por ello, una opción interesante para el desarrollo de un inoculante amigable para la inoculación en el surco de siembra en cultivos extensivos es la obtención de un inoculante granulado. Esta opción brinda, además, la oportunidad de combinar en el mismo inoculante diversas cepas de rizobios noduladores de soja con bacterias promotoras del crecimiento vegetal y sustancias promotoras del crecimiento bacteriano, separando al mismo tiempo a los rizobios de compuestos con potenciales efectos perjudiciales, como curasemillas o metales pesados.

RESPUESTA SEVERA EN Bradyrhizobium diazoefficiens Y SU RELACIÓN CON LA SIMBIOSIS EN SOJA.
Julieta Pérez Giménez
El objetivo de este proyecto es estudiar la respuesta severa de B. diazoefficiens frente a la escasez de nutrientes y su efecto en la simbiosis con soja. En nuestro laboratorio se encontró que cuando los rizobios se cultivan en escasez de fuente de N resultan más infectivos y competitivos para nodular soja. En esta condición estaría disparada la respuesta severa (stringent response) que conduce al aumento del segundo mensajero (p)ppGpp en el citoplasma de la bacteria. Este nucleótido regula la expresión de un gran número de genes que conduce a la bacteria a adaptarse al nuevo estado fisiológico. Está demostrado que esta respuesta es crucial para una exitosa interacción rizobio–leguminosa. Como aún no ha sido estudiada en profundidad en B. diazoefficiens, estamos en un principio analizando el metaboloma de la cepa salvaje en comparación con una mutante en el gen rsh (cuya proteína es responsable de la síntesis del segundo mensajero, incapaz de sinterizar (p)ppGpp), frente a la falta de carbono y nitrógeno. Este proyecto incluye la identificación a través de herramientas transcriptómicas de los genes que se encuentran regulados por (p)ppGpp en B. diazoefficiens y la integración de estos resultados junto con la obtención de los proteomas en condiciones similares. Luego de la validación de los resultados obtenidos, se analizará el rol de los genes detectados en la simbiosis mediante la generación de mutantes y la evaluación de su función en la simbiosis. El avance en el conocimiento de las vías que se regulan mediante el (p)ppGpp en B. diazoefficiens nos ayudará a comprender el metabolismo de esta bacteria cuando se la somete a estrés nutricional. Esto podría ser un punto de partida para entender por qué estos rizobios resultan más eficientes en su simbiosis con plantas de soja cuando se los cultiva es escasez de N. En conjunto la información generada podría ser la base para una nueva formulación de inoculantes para soja.

REGULACIÓN GLOBAL DEL METABOLISMO DE NITRÓGENO EN Bradyrhizobium diazoefficiens Y SU APROVECHAMIENTO EN EL MEJORAMIENTO DE LA NODULACIÓN DE SOJA.
Florencia Lamelza, Silvina López García
Este proyecto involucra aspectos básicos y aplicados del estudio de la regulación del metabolismo de nitrógeno en los rizobios. Dado que el suelo es un hábitat en el cual las condiciones pueden ser desfavorables, los rizobios se ven obligados a adaptarse a ese ambiente y en esas condiciones llevar a cabo en forma eficiente la asociación con las leguminosas. En este sentido, el N es de primordial importancia debido a que la fijación simbiótica de N por parte de los rizobios sólo se lleva a cabo cuando el N asimilable para la planta es escaso por lo que los rizobios poseen mecanismos específicos que les permiten captar y asimilar el N presente aún en bajas concentraciones, siendo la cascada de respuesta al estrés por nitrógeno (NSR) un ejemplo de estos. Nuestra línea de investigación se ha enmarcado en esta temática, y estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado una influencia positiva de las condiciones de inanición de N sobre los procesos tempranos de interacción entre Bradyrhizobium diazoefficiens, simbionte de las plantas de soja, y dicha leguminosa. Así, nuestro trabajo está relacionado con la caracterización fenotípica de distintos mutantes en genes fundamentales que participan en la NSR en este rizobio, tanto en vida libre como en simbiosis. A partir de los resultados obtenidos, hemos logrado un amplio avance en la comprensión de la regulación del metabolismo de N en B. diazoefficiens, y a futuro, esperamos utilizar el conocimiento adquirido para intentar mejorar la eficiencia de los inoculantes y así lograr una mayor productividad del cultivo de soja.

ROL DEL SISTEMA DE DOS COMPONENTES NtrYX EN Bradyrhizobium diazoefficiens Y SU INFLUENCIA EN LA SIMBIOSIS CON SOJA.
Valeria Hegel, Silvina López García
Los rizobios son bacterias capaces de crecer en vida libre a expensas de los nutrientes del suelo o en asociación simbiótica con plantas de soja. Tanto en el suelo como en su interacción con la planta, estas bacterias pueden estar sometidas a una amplia variedad de estreses ambientales. En particular, el estrés al que se somete a las bacterias en su ambiente podría determinar un profundo cambio en la regulación de sus actividades metabólicas. La capacidad de la mayoría de las bacterias para monitorear y adaptarse a las condiciones ambientales es frecuentemente mediada a través de sistemas de transducción de señales que involucran sistemas de dos componentes (TCS). Los TCS generalmente consisten en una histidina kinasa sensora y un regulador de respuesta, quien finalmente se une a los promotores de los genes blanco, facilitando así su transcripción.
Nuestro grupo de investigación comenzó estudiando el sistema de dos componentes NtrBC involucrado en la respuesta al estrés por nitróegno (NSR). Contiguo a este sistema se encuentra otro sistema de dos componentes denominado NtrYX y según los pocos reportes que existen acerca del mismo en la literatura, parecería que este sistema está involucrado en diferentes procesos. Hasta el momento, se desconoce por completo la función de este sistema de reguladores en B. diazoefficiens. Nuestro objetivo es entonces profundizar el rol de NtrYX en este rizobio y estudiar si existe alguna vinculación con el sistema NtrBC, con la respuesta NSR y con la fijación simbiótica de N. Asimismo, estamos evaluando si este sistema se encuentra involucrado en la tolerancia a diferentes estreses. Los resultados hasta aquí obtenidos sugieren ntrY es un gen pleiotrópico en este rizobio, ya que está involucrado en varios procesos evaluados.